Hija del archiduque Carlos de Estiria y de la archiduquesa María de Baviera, en 1599, se casó con Felipe III, en un matrimonio destinado a consolidar la alianza entre, la rama española y la rama austriaca, de los Habsburgo. El matrimonio fue celebrado por poderes en Ferrara, el día de San Leopoldo, patrón de la Casa de Austria, para ser confirmado luego en Madrid.
Se acordó a la vez, el enlace entre Isabel Clara Eugenia, hija menor de Felipe II, y el archiduque Alberto de Austria. El día 3 de febrero de 1599, se dirigieron hacia Génova, donde el Almirante de Castilla, Andrea Doria, les esperaba con una armada de cuarenta galeras. El día 10, pusieron rumbo a Valencia. Lope de Vega, hace mención de las bodas en su comedia "El catalán valeroso". Después de las fiestas, los reyes marcharon a Barcelona, donde reunieron Cortes. En Zaragoza, juró el rey, los Fueros y se dió libertad, a la familia de Antonio Pérez.
En 1600, por consejo del duque de Lerma, se traslada la corte, a Valladolid, instalándose los reyes, en el palacio del duque de Benavente. Pero los servicios oficiales, no cabían en la ciudad y estaban dispersos; de hecho, la chancillería, se instaló en Medina del Campo y la feria, hubo de ser trasladada a Burgos. En 1606, el rey decide volver a Madrid. Ya, como reina de España, se enfrentó al duque de Lerma, el valido de su marido, a causa de la gran influencia que éste, tenía sobre los asuntos del reino. Lerma, en represalia, hizo despedir a su servidumbre alemana y logró que Margarita, no pudiese recibir memoriales o peticiones, cosa que disminuía su influencia en la corte. Margarita, apoyada por el confesor real, fray Luis de Aliaga, promovió el procesamiento, por corrupción de varios de los hombres de confianza de Lerma, entre ellos, Rodrigo Calderón, que fue absuelto. Durante toda su vida, la Reina manifestó interés por la vida espiritual; mantuvo conversaciones e intercambios epistolares, con personalidades religiosas significativas dentro de España, como con, sor Mariana de San José, monja fundadora del convento de La Encarnación, obra fundacional a la que la reina Margarita aportó obras de arte y dotaciones monetarias. También, fue lectora de obras de San Ignacio de Loyola, Santa Teresa de Jesús o San Juan de Dios. Margarita y Felipe tuvieron ocho hijos, no sobrepasando, algunos de ellos, la edad infantil; Ana María Mauricia, esposa de Luis XIII; el futuro Felipe IV; María Ana, esposa de Fernando III y Carlos y Fernando, el cardenal infante. La Reina murió, debido a las complicaciones del octavo parto.